Serien-Datensammlung für Trypsin-Kristalle

Trypsin aus Bauchspeicheldrüsen von Rindern wurde hinsichtlich der Kristallisationsbedingungen mithilfe der Rigaku Reagents Wizard Classic 1 & 2 Screens und mittels MiTeGen In Situ-1™ Kristallisationsplatte untersucht. Im Anschluss an die Inkubationsperiode bei 18°C wurde die Platte auf die XtalCheck Apparatur aufgebracht, die auf das XtaLAB MM007-HF Diffraktometersystem angebracht wurde, das mit der MicroMax™-007 HF Mikrofokus-Rotieranode sowie der VariMax HF Optik und dem PILATUS3 R 200K Hybridphotonen-Zähldetektor konfiguriert wurde.

Daten wurden für sechs unterschiedliche Trypsin-Kristalle aus einem Kristallisationstropfen in Well H5 gesammelt. Für jeden Kristall wurden insgesamt 43 Grad Daten mit einer Expositionszeit von 3 Sekunden pro 0.25° gesammelt. Im Anschluss an die Datensammlung wurden die Daten mithilfe des HKL03000R1 ausgewertet. Jeder Kristall wurde mit ähnlichen Zellenparametern in einem primitiven orthorombischen Kristallgitter katalogisiert.

Jeder Datenscan wurde unabhängig voneinander integriert und alle Scans wurden miteinander in Verhältnis gebracht. Die dementsprechende Datenverarbeitungs-Statistik kann Tabelle 1 entnommen werden. Die Daten zusammengefasst betragen eine Gesamtheit von 96% für alle Daten und 84.9% für die höchste Auflösungsschale. R-symm und R-meas betragen 2,9% und 5.4%. Maßstabsgetreue Berechnungen ergaben ein Auflösungslimit für alle Daten jenseits von 2.0 Å, vorausgesetzt dass / deutlich größer als 2 am Detektorrand beträgt.

Raumgruppe   P2₁2₁2₁
Durchschnittliche Länge der Elementarzelle   54.91 Å, 58.62 Å, 67.49 Å
Auflösung   1.96 Å
Mosaizität   0.29° - 0.42°
# Reflektionen / # einzigartig   79840 / 16227
# Reflektionen rejected / %   364 / 0.46
Redundanz (letzte Schale)   5.1 (27)
Vollständigkeit (letzte Schale)   96.% (84.9%)
<I>/<σ/(I)> (letzte Schale)   84.9 (6.7)
Vereinte R-symm / R-meas   2.9% / 5.4%
Chi² (letzte Schale)   1.119 (1.972)

Das HKL-3000R wurde genutzt, um Drittanbieterprogramme für Strukturauflösungsprogramme mittels molekularem Replacement nutzen zu können, inklusive CCP4, ARP/wARP und Coot. Vor dem molekularen Replacement wurde die 1BTY PDB Datei für die Entfernung der Seitenketten, Wassermoleküle und Liganden bearbeitet. Danach wurde MOLREP mit einem Auflösungslimit von 3.0 Å zur Anbringung einer einzelnen Kette zum Suchmodell genutzt. Die Struktur wurde automatisch mithilfe von 3 Zyklen von ARP/wARP rekonstruiert. Das darausfolgende Modell beinhaltete Rest 7 bis 224 mit einem R = 17.0% und Rfree = 22.5%. Danach wurden 10 Verfeinerungszyklen ausgeführt, mit einem abschließendem R = 15.8% und Rfree = 21.4% für Refmac. Abbildung 4 zeigt die 2Fo – Fc Karte mit dem Modell.

Xtalcheck
2Fo-Fc Elektronendichtekarte (blau) konturiert bei 1σ und verfeinert bis auf 2.0 Å, aufgezeigt mit Overlay-Struktur Autobuiltsystem ARP/wARP und verfeinert mit Refmac.